Enzimi di restrizione
Che cosa sono gli enzimi di restrizione?
Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi in grado di riconoscere delle sequenze specifiche di nucleotidi lungo un filamento di DNA e di catalizzare un taglio (un'idrolisi) esattamente in corrispondenza di esse.
La loro scoperta è avvenuta mediante l'osservazione che il DNA proveniente da un ceppo di Escherichia coli se introdotto (tramite trasformazione batterica) in un ceppo diverso, veniva letteralmente tagliato in piccoli frammenti.
In seguito si osservò che la stessa cosa accadeva al DNA virale quando i batteri venivano infettati. Ovvero, il DNA del virus veniva fatto a pezzettini e questi frammenti erano così resi inattivi.
Si disse che la crescita virale era ristretta in un determinato ceppo batterico, da qui il termine "restrizione" per definire gli enzimi in grado di fare quanto osservato.
In particolare i batteri possiedono quelle che vengono definite endonucleasi di restrizione, enzimi che tagliano i legami interni ad una certa sequenza nucleotidica sia essa di un filamento di DNA o all'interno di DNA circolare.
Il codice genetico del batterio è protetto dal taglio proteolitico di questi speciali enzimi grazie a delle modificazioni presenti nelle sue sequenze di nucleotidi che sono opera di un altro tipo di enzima.
In a il taglio operato da un enzima di restrizione, in b la stessa sequenza di basi subisce metilazione e non è più riconosciuta dall'enzima di restrizione.
Si tratta di metilasi che riconoscono la stessa sequenza delle endonucleasi di restrizione ma catalizzano la sua modificazione, in particolare vi aggiungono un gruppo metile (da qui il nome metilasi). Questa piccola modifica chimica rende il nucleotide non riconoscibile da parte degli enzimi di restrizione e dunque protetto dal taglio enzimatico.
I virus, i batteriofagi che sono in grado di infettare i batteri, non possiedono metilasi, dunque il loro DNA è attaccabile dagli enzimi di restrizione.
Gli enzimi di restrizione rappresentano una sorta di primitivo sistema immunitario a difesa dei batteri.
Classificazione degli enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono classificati in 3 classi: tipo I, tipo II e tipo III.
Tipo I e III necessitano di energia per operare il taglio, in particolare il tipo I opera tagli casuali sul DNA, non riconosce sequenze specifiche ma sequenze di 3/4 paia di basi separate da 6/8 paia di basi non specifiche.
Gli enzimi appartenenti al tipo III riconoscono invece sequenze di 5/6 basi ma tagliano fino a 25 paia di basi di distanza dalla sequenza riconosciuta ed inoltre endonucleasi e metilasi si trovano sullo stesso enzima.
Gli enzimi di restrizione di tipo II invece sono in grado di riconoscere sequenze specifiche di nucleotidi, dette palindromiche, ossia sequenze simmetriche se lette sulle due emieliche di DNA in direzione 5'à3'. Il termine palindromo proviene dal greco palin (= indietro) e dromw (= corro) ed indica un verso che, letto da sinistra o da destra, ha lo stesso significato.
Esempi di parole palindromiche sono: osso, ama, oro. Esistono anche frasi come: "ai lati d'Italia".
Questa terza classe di enzimi di restrizione è quella largamente utilizzata nelle biotecnologie che infine ne ha reso possibile l'espansione e le molteplici applicazioni.
Le endonucleasi di tipo II hanno possono inoltre essere sotto classificate a seconda del tipo di taglio che sono in grado di effettuare, in particolare alcuni di essi generano estremità "piatte" dei due filamenti di DNA tagliato poiché tagliano a metà della sequenza di riconoscimento, operano cioè un taglio netto. Altri enzimi operano invece un taglio che genera estremità "sporgenti".
Tipi di taglio degli enzimi di restrizione e generazione di estremità sporgenti coesive oppure piatte.
EcoRI è una endonucleasi di restrizione che genera frammenti con estremità “sporgenti”.
Tra i nucleotidi delle due estremità sporgenti si possono creare ponti a idrogeno perciò tali estremità risultano coesive.
Le estremità così ottenute di due frammenti di DNA possono essere saldate tra loro grazie all'azione catalitica di un altro tipo di enzimi, le DNA ligasi.
Per poter essere tra loro legati i due frammenti diversi di DNA devono essere stati trattati con lo stesso enzima di restrizione in maniera tale che le estremità coesive prodotte siano tra loro complementari.
Le DNA ligasi sono in grado di "cucire" tra loro gli scheletri di zucchero-fosfato dei filamenti di acido desossiribonucleico.
Nomenclatura degli enzimi di restrizione
Esistono diversi enzimi di restrizione, ogni batterio ne produce molti e ad oggi ne conosciamo circa un migliaio differenti che vengono identificate mediante un sistema di nomenclatura apposito che presenta lettere che si riferiscono alla specie ed al ceppo batterico dal quale sono stati isolati e numeri che indicano l'ordine nel quale sono stati purificati. La figura seguente riporta per esempio la nomenclatura per EcoRI.
Di seguito si riporta una tabella nella quale sono presenti le sequenze riconosciute da alcuni enzimi di restrizione ed il tipo di taglio e quindi estremità generati.
Attualmente gli enzimi di restrizione sono purificati dai batteri ad opera di industrie biotecnologiche e venduti a scopo ricerca. Gli enzimi di restrizione presentano infatti un largo uso e come dicevamo prima hanno rappresentato la chiave di volta per le applicazioni nelle biotecnologie. Grazie ad essi infatti è possibile "tagliare e cucire" in maniera controllata il DNA.
Applicazioni degli enzimi di restrizione
Le due principali applicazioni degli enzimi di restrizione in biologia molecolare, quindi come biotecnologie, sono le seguenti:
- DNA ricombinante: con questo termine si intende la possibilità di ottenere un DNA ibrido a partire da due frammenti di origine diversa. Entrambe le molecole d'origine vengono trattate con lo stesso tipo di enzima di restrizione in maniera da ottenere estremità sporgenti coesive che mediante l'opera di DNA ligasi permettono di ottenere la molecola ibrida desiderata.
- diagnosi di polimorfismi: per polimorfismo a singolo nucleotide si intende una variazione a carico di un solo nucleotide che si presenta tra individui della stessa specie, definito in inglese single nucleotide polymorphism o SNP (pronuncia SNIP). Attrverso gli enzimi di restrizione è possibile individuare la presenza di uno SNP attraverso la cosiddetta restriction fragment length polymorplysm (RFLP: polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione). Tale tecnica si basa sul fatto che se un allele contiene il sito di riconoscimento per un enzima di restrizione e l'altro allele no, in seguito alla digestione di entrambi gli alleli con l'endonucleasi si genereranno due frammenti di dimensione differente.
I due diversi alleli verranno riconosciuti tramite elettroforesi su gel di agarosio poiché i frammenti generati dal taglio enzimatico avendo diverse dimensioni correranno in maniera diversa sul gel.
In elettroforesi su gel di agarosio il DNA è sottoposto ad un campo elettrico, i campioni sono posizionati in appositi pozzetti creati nel gel e al termine dell'analisi avranno generato delle bande (visibili tramite i raggi ultravioletti poiché per il DNA si utilizza un intercalante le basi che emette in questa lunghezza d'onda) che si saranno spostate (avranno corso) di più o di meno in proporzione al loro peso ovvero al numero di nucleotidi di cui si compone il frammento.
Elettroforesi su gel di agarosio.
La figura mostra lo schema di un'elettroforesi su gel di agarosio, da sinistra possiamo distinguere la corsa di bande marker di dimensioni note, quindi i due alleli polimorfici.
Il primo è eterozigote, il secondo omozigote, nel primo quindi si notano i due frammenti di diversa lunghezza generati dal fatto che un allele (quello normale) ha una dimensione, l'altro, quello mutato un'altra.
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