Endonucleasi
Che cosa sono le endonucleasi?
I termini endonucleasi ed esonucleasi si riferiscono ad enzimi della categoria delle nucleasi. Le nucleasi sono enzimi che tagliano legami fosfodiesterici tra nucleotidi adiacenti in molecole di acido nucleico. Essi sono di grande utilità nelle tecniche di manipolazione del DNA.
Le endonucleasi rompono i legami fosfodiesterici all'interno delle molecole di acido nucleico, mentre le esonucleasi alle estremità, da cui rimuovono uno o più nucleotidi.
L'attività esonucleasica è propria anche di alcune DNA polimerasi e tra le endonucleasi più note si ricordano gli enzimi di restrizione, la cui scoperta negli anni '60 del secolo scorso ha dato avvio alla messa a punto delle tecnologie del DNA ricombinante.
In genere, le nucleasi sono specifiche per il DNA o l'RNA e alcune distinguono tra molecole di DNA a singolo o a doppio filamento e, in quest'ultimo caso, tagliano a livello di uno solo o di entrambi i filamenti. Altre nucleasi sono, invece, molto più versatili.
Schema generale dell'attività delle endonucleasi e delle esonucleasi. Le endonucleasi effettuano dei tagli all'interno delle molecole di acido nucleico generando frammenti di varia lunghezza. Le esonucleasi, agendo sulle estremità degli acidi nucleici, rimuovono da esse uno più nucleotidi.
Esempi di endonucleasi del DNA
Le endonucleasi del DNA possono distinguersi in base al taglio effettuato all'interno di singoli o doppi filamenti.
L'endonucleasi S1, estratta dal fungo Aspergillus oryzae, taglia i legami fosfodiesterici all'interno di un solo filamento, mentre la DNasi I o deossiribonucleasi I, di solito ottenuta dal pancreas di mucca, taglia a livello di qualsiasi legame fosfodiesterico in molecole di DNA a singolo o a doppio filamento, rilasciando una miscela di mononucleotidi e oligonucleotidi.
Un tipo particolare di endonucleasi, molto utilizzate nelle tecniche del DNA ricombinante, sono gli enzimi di restrizione, capaci di tagliare legami fosfodiesterici di entrambi i filamenti di sequenze più o meno specifiche di DNA.
Tipi di endonucleasi. L'enzima S1(a) taglia i legami fosfodiesterici all'interno di molecole di DNA a singolo filamento, mentre la DNasi I (b) agisce su singoli e doppi filamenti. Gli enzimi di restrizione (c) sono particolari endonucleasi che tagliano entrambi i filamenti di sequenze nucleotidiche più o meno specifiche.
Endonucleasi di restrizione
Le endonucleasi o enzimi di restrizione sono in grado di legare una molecola di DNA a livello di una particolare sequenza e di effettuare un taglio all'interno o in prossimità di essa. Gli enzimi di restrizione sono presenti in diverse specie batteriche dove rappresentano uno strumento di difesa dall'infezione di alcuni fagi di cui ne tagliano il DNA.
Esistono tre tipi di endonucleasi di restrizione, delle quali quelle di tipo I e di tipo III effettuano tagli non prevedibili e controllabili in sequenze a valle o adiacenti a quella di riconoscimento. Esse sono, pertanto, di poca utilità nelle tecniche di manipolazione del DNA. Gli enzimi di tipo II sono di gran lunga più versatili. Essi tagliano sempre nella stessa posizione, all'interno della sequenza di riconoscimento o in prossimità di essa.
Le sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione di tipo II hanno generalmente una lunghezza di 4-8 pb (paia di basi) e sono palindromiche, vale a dire si leggono allo stesso modo su entrambi i filamenti, se si procede in direzione 5'-3' o 3'-5'.
Alcuni enzimi di tipo II effettuano tagli simmetrici su entrambi i filamenti generando frammenti con estremità piatte, altri tagliano i due filamenti in posizione sfalsate di due o quattro nucleotidi e i frammenti che si ottengono presentano sporgenze a singolo filamento. In quest'ultimo caso si parla di estremità coesive o appiccicose.
Esempi dell'attività di alcuni enzimi di restrizione. L'azione degli enzimi di restrizione nelle pratiche di laboratorio è più propriamente detta digestione. Gli enzimi HindIII e PstI producono estremità coesive perché effettuano sulla sequenza di riconoscimento tagli asimmetrici. L'enzima EcoRV produce, invece, estremità piatte. Si noti come le sequenze riconosciute siamo palindromiche.
Altre endonucleasi del DNA
L'attività endonucleasica si rinviene in diversi altri enzimi presenti nei procarioti e negli eucarioti.
L'endonucleasi AP interviene nei meccanismi di riparazione del DNA per escissione di basi.
L'endonucleasi HO avvia il processo di conversione genica, noto come conversione del mating type, dei lieviti, producendo un taglio a doppio filamento all'interno del gene MAT.
Negli eucarioti l'endonucleasi flap, FEN1, partecipa, insieme ad altri enzimi, alla rimozione dei primer di ciascun frammento di Okazaki del filamento lagging durante la duplicazione del DNA.
Diverse altre endonucleasi intervengono, negli eucarioti, nei meccanismi di splicing degli introni.
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